主要な研究成果

 

 

ミクログリアの多様性と神経障害性疼痛（総説）

がんや糖尿病，帯状疱疹，脳梗塞などで神経が傷つくと，非常に長引く痛みを発症する場合があります。この慢性疼痛は神経障害性疼痛と呼ばれ，解熱鎮痛薬などの一般的な薬では抑えることができず，モルヒネのような強い薬でも効かないことがあり，治療に難渋する痛みです。 私たちは，2003年に神経障害性疼痛の発症に脊髄のミクログリアが重要であることをNature誌に発表し，それ以来，その分子細胞メカニズムを明らかにしてきました。さらに最近，神経損傷後にミクログリア細胞の一部が変化し，CD11c陽性ミクログリアとなり，それが神経障害性疼痛の寛解に必須であることを発見しました（2022年Science誌に掲載）。今回の総説では，ミクログリアの多様性から見えてきた神経障害性疼痛の新しいメカニズムと，創薬を含めた将来展望などを論じています。

長引くかゆみ，何回も引っ掻くと神経で増えるタンパク質が原因！

かゆみを感じたとき、私たちはかゆいところを引っ掻きます。通常であれば、数回引っ掻くとかゆみは治まりますが、アトピー性皮膚炎や接触皮膚炎などに伴う慢性的な強いかゆみだと、何回も繰り返して引っ掻いてしまいます。それによって皮膚の炎症が悪化し、その結果、かゆみがさらに増すという悪循環となってしまいます。これは、「かゆみと掻破（そうは）の悪循環」と呼ばれ、かゆみを長引かせる大きな原因と考えられていますが、そのメカニズムはまだよく分かっていません。
　何回も繰り返し皮膚を引っ掻く、アトピー性皮膚炎や接触皮膚炎モデルマウスで研究を行い、皮膚からのかゆみ信号を脳へ送る脊髄神経（かゆみ伝達神経）の活動が高まっていること、皮膚への引っ掻き刺激を抑えるとそれが起こらないことを見いだしました。さらに、皮膚を繰り返し引っ掻くことで、皮膚と脊髄をつなぐ感覚神経でNPTX2というタンパク質が増え、これが脊髄のかゆみ伝達神経に作用すると、その神経の活動が高まってしまうことを発見しました。実際に、NPTX2を無くしたマウスでは、脊髄のかゆみ信号伝達神経の活動が低下し、かゆみも軽減しました。この研究成果から、皮膚炎モデルマウスで見られる長引くかゆみには、かゆい皮膚を何回も引っ掻くことで作られる神経のタンパク質NPTX2と、それによるかゆみ信号伝達神経の活動の高まりが原因であることが明らかになり、慢性的なかゆみのメカニズムの解明と、かゆみを鎮める治療薬の開発に向けた大きな一歩となると考えられます。

脳を覆う特殊な免疫細胞の成り立ちと特性を解明

全身機能の司令塔として知られる脳は、神経細胞のみならず多種多様な細胞の相互作用によって、その高度な機能が維持されています。そのため、脳がどのような細胞によって構成され、各細胞がどういった特性を有しているのか理解することは、脳の機能を正確に理解するために必要不可欠であり、また脳疾患の発症メカニズムの解明へ向け、重要かつ喫緊の課題であると考えられます。
　本研究では、これまで全く研究が進んでいなかった脳境界マクロファージという特殊な免疫細胞の動向を正確に捉え、その成り立ちや細胞特性を解明することに成功し、それに加えて脳の形成に関わる新たな仕組みを見出しました。
　単一細胞解析法やFate-mapping法という最新研究技術ならびに独自開発した遺伝子改変ツールを駆使して、胎児から成体に至る幅広いライフステージにおいて脳境界マクロファージを詳細に解析し、それらが脳境界領域に定着する仕組み、さらにはそれら細胞が持つ遺伝子的また機能的特性を世界で初めて明らかにしました。
　今回の発見は、脳の形成メカニズムに新たな概念を付加すると同時に、認知症や自閉スペクトラム症といった多くの脳疾患の発症メカニズム解明に大きく貢献することが期待され、将来的には脳内免疫細胞を標的とした新たな治療法・新薬の開発に役立つことが期待されます。

慢性疼痛からの自然回復に必要な細胞を世界で初めて発見！～ミクログリア細胞の驚くべき変化～

がんや糖尿病，帯状疱疹，脳梗塞などで神経が傷つくと，非常に長引く痛みを発症する場合があります。この慢性疼痛は神経障害性疼痛と呼ばれ、解熱鎮痛薬などの一般的な薬では抑えることができず，モルヒネのような強い薬でも効かないことがあり，治療に難渋する痛みです。基礎研究に用いるマウスでも，ある神経を傷つけると数日で痛みが出現し，数週間持続する慢性疼痛を発症します。しかし，この場合，不思議なことに，神経の傷は治っていないのにその痛みは徐々に和らいできます。なぜ，痛みが自然に弱くなっていくのか，そのメカニズムはこれまで不明でした。今回の研究では，痛みからの自然回復に必要な細胞を世界で初めて発見しました。驚くことに，この細胞はこれまで痛みの発症原因とされてきたミクログリア細胞の一部が変化したものであり，その細胞を無くしたマウスでは痛みからの回復が起こらず，長い間痛みが持続しました。このミクログリア細胞がIGF1という物質を作り出し，それが痛みを和らげることも明らかにしました。今回の成果から、これまで痛みの発症に関わるとされてきたミクログリア細胞の新たな側面が明らかになり、今後、神経障害性疼痛などの慢性疼痛に有効な治療薬の開発につながることが期待されます。

触っただけで痛みがでるのはなぜ？　～厄介な痛みに重要な神経細胞を特定～

神経障害性疼痛では，皮膚に軽く触れるような刺激でも痛みがでる「アロディニア」という症状があり，モルヒネも効き難く，治療に難渋することが知られています。皮膚からの触覚と痛覚信号はそれぞれ区別された神経を伝わるため，通常であれば触刺激で痛みがでることはありませんが，神経系が障害を受けた後ではなぜそれが起こるのでしょうか？今回の研究では，そのメカニズムの解明につながる重要な神経細胞（AAV-NpyP神経：AAVに搭載したNPYプロモーターで制御される神経）を特定し，それが神経障害性アロディニアに深く関わることを世界で初めて明らかにしました。この神経は脊髄の表層に局在し，神経障害後にアロディニアを呈しているネズミでは活動性が低下していました。さらに，その低下した神経活動を高めるとアロディニアが緩和され，逆に，正常のネズミの神経活動を人工的に低下させるとアロディニアが発症しました。したがって，今回特定した神経の活動を高める化合物が見つかれば，神経障害性疼痛に有効な治療薬の開発につながる可能性があります。

新しいアストロサイト亜集団を発見　～痛覚制御メカニズムの定説が変わる？～

今から約１６０年前，グリア細胞の一つであるアストロサイトは神経と神経のすき間を埋めるものとされ，長らくその役割は不明でした。しかし近年になり，アストロサイトは神経の働きに大切な細胞で，病気にも深く関わることが徐々にわかってきました。脳や脊髄は多くの場所で区分けされており，神経の種類と役割もそれぞれで異なります。アストロサイトも脳や脊髄全体に分布していますが，神経のようにそれぞれの場所で種類と役割が違うのでしょうか？ この研究では，皮膚の感覚信号を脳へ伝える脊髄の後角という場所の「表層」に他の層とは違うアストロサイトが存在することを世界で初めて発見し，この細胞を刺激すると痛覚過敏になることを明らかにしました。しかし不思議なことに，このアストロサイトは，痛みを抑えるとされてきたノルアドレナリン神経で刺激されることもわかりました。すなわち，これまで痛みを抑える作用が常識であったノルアドレナリン神経に，まったく逆の作用があることがこのアストロサイトの発見により明らかとなったのです。 鎮痛薬として処方されるデュロキセチンはノルアドレナリン神経に作用します。もし今回の発見が本当であれば，このアストロサイトの働きを弱めることで，デュロキセチンの鎮痛作用を高めることができるはずです。そこで私たちは，この仮説を検証するために，アストロサイトの活動を弱めたマウスを作製し，確かにデュロキセチンの鎮痛作用が高まることを実証しました。 私たちは新しいアストロサイトを発見し，その細胞の研究から新しい痛覚制御メカニズムを明らかにしました。この成果により，鎮痛薬のポテンシャルを効率よく引き出す新しい医薬品の開発に繋がることが期待されます。

長引く痒みに関係するアストロサイトの活性化メカニズムを発見

慢性的な痒みは，アトピー性皮膚炎をはじめ様々な病気で起こることが知られています。抗ヒスタミン薬などの既存薬ではかゆみを十分に抑えることが難しいため，一刻も早いメカニズムの解明とそれを基盤とした創薬開発が期待されています。以前に私たちはは，炎症を起こした皮膚と末梢神経で繋がっている脊髄後角で，転写因子STAT3によってアストロサイトが長期に活性化し，それにより産生されたリポカリン2（LCN2）が痒み信号を強め，慢性的なかゆみに寄与することを明らかにしていました（2015年Nat Med，2020年JACI掲載論文）。しかし，アストロサイトがどのような仕組みで長期的に活性化しているのかは不明でした。今回の研究では，STAT3活性化因子として知られていたIL-6の発現が皮膚炎マウスの末梢神経で増加し，それが脊髄後角アストロサイトに作用して1型IP3受容体やTRPCチャネルを介する細胞内カルシウム上昇を起こし，長期的なSTAT3活性化を誘導することを突き止めました。さらに，末梢神経のIL-6，アストロサイトの1型IP3受容体やTRPCの発現あるいは活動を抑制することで，皮膚炎マウスで見られる脊髄後角アストロサイトの活性化，LCN2発現，そして引っ掻き行動が抑えられることも明らかにしました。

皮膚からのかゆみ信号が脊髄で強まるメカニズムを発見

皮膚炎などで起こる慢性的なかゆみは，過剰な引掻き行動を起こし，それが原因で皮膚炎が悪化，さらにかゆみが増すという悪循環に陥ります。これは「かゆみと掻破の悪循環」といわれ，かゆみを慢性化させる大きな原因と考えられています。しかし，どのようなメカニズムでかゆみが強まり，過剰に引掻いてしまうのかはよく分かっていません。この研究では，慢性的なかゆみを発症する接触皮膚炎モデルマウスを用い，アストロサイトから放出されるリポカリン2が，かゆみの伝達に大切なGRPR陽性脊髄後角神経に作用し，その活動を強めてしまうことを世界で初めて明らかにしました。実際に，ゲノム編集技術を使ってアストロサイトだけでリポカリン2を欠損させたマウスでは，かゆみ信号の強まりと過剰な引掻き行動，そして皮膚炎が抑制されました。

皮膚からの痒みを伝える神経の刺激因子を特定

痒みは掻きたいという欲望を起こさせる不快な感覚です。しかし，痒みという感覚がどのように発生するのかなど，その仕組みはほとんど分かっていません。最近，MrgprA3というタンパク質を作る神経を無くすと痒みが弱くなることが報告され（Nat Neurosci 16: 174-182, 2013），この神経が皮膚からの痒みを伝える神経として注目されています。しかし，この神経を刺激する因子はこれまで不明でした。この研究では，細胞外のATPがこの痒み神経を刺激する因子であることを突き止めました。同研究グループは，ATPが作用するP2X3受容体（神経を興奮させるタンパク質）がMrgprA3神経にあること，そして皮膚にATPをマウスの皮膚に注射すると痒み行動が出現することを明らかにしました。また，皮膚を激しく引掻くアトピー性皮膚炎モデルマウスでは，P2X3受容体が増え，その受容体の活動を薬物で抑えると慢性的な痒みが緩和されることも明らかにしました。

神経障害性疼痛とミクログリア－細胞分子メカニズムと創薬－（総説）

がん，糖尿病，帯状疱疹あるいは脳卒中などで神経に障害が起きると，抗炎症薬やモルヒネなどの鎮痛薬が効きにくい「神経障害性疼痛」という慢性痛が発症します。しかし，そのメカニズムは依然明らかになっておらず，著効を示す治療法もありません。

我々の研究グループは，2003年にP2X4受容体がミクログリアで増え，その刺激が神経障害性疼痛に重要であることをNature誌に発表し，それ以来，神経障害性疼痛とミクログリアに関する研究成果を数多く発表し，神経損傷後の脊髄で活性化したミクログリアが慢性的な痛みを引き起こしていることを明らかにしてきました（Nature 2003; Nature 2005; PNAS 2009; EMBO J 2011; Cell Rep 2012; Nature Commun 2014; Nature Commun 2016など）。今回の総説では，これまで全世界で報告されてきた神経障害性疼痛におけるミクログリアの役割に関する科学的エビデンスから，現在までに明らかになった細胞・分子メカニズム，そして創薬を含めた将来展望などを論じています。

オプトジェネティックス法による神経障害性アロディニアの新規評価法

神経障害性のアロディニアは，触刺激で誘発される痛みであるため，触刺激を脊髄や脳へ伝える一次求心性Aβ線維を介した神経経路の異常が原因の一つと想定されています。しかし，そのメカニズムはよく分かっていません。その原因の一つは，Aβ線維の活動を選択的に制御する方法がないためです。私たちは今回，オプトジェネティックス法（光感受性タンパク質を特定の神経に発現させ，光でその神経活動を選択的に制御できる手法）によりこの問題を解決しました。一次求心性神経Aβ線維に青色光で活性化するChR2を発現するトランスジェニックラットを用いて，神経障害性疼痛モデルを作製し，同ラットの足底部を光で刺激することで痛み様の行動が誘発されることを見出しました。また，通常ではAβ線維刺激で興奮することのない脊髄後角第I層ニューロン（痛みを脳へ伝える）が神経障害後では興奮し，さらに，痛みに伴う情動的嫌悪反応も誘発されました。したがって，神経損傷後にAβ線維の刺激が痛み行動，すなわちアロディニアを発症するのに十分な刺激であることを世界で初めて示しました。加えて，光刺激によるアロディニアにはモルヒネが無効であったため，このモデルが神経障害性アロディニアのメカニズム解明と新薬開発に資する新規評価法となりえる可能性が考えられます。

神経障害性疼痛に直結する細胞外ATPの放出源を特定

私たちはこれまでに，神経障害性疼痛モデルの脊髄後角ミクログリアでP2X4受容体などのATP受容体の発現が増加し，その活性化が神経障害性疼痛に重要であることを明らかにしてきました。これらの受容体は細胞外ATPによって活性化されますが，脊髄後角内でATPがどの細胞からどのような仕組みで細胞外へ放出されるのかは長年の謎でした。今回，私たちはヌクレオチドトランスポーター「VNUT」に注目して研究を行い，神経障害性疼痛モデルの脊髄でVNUTの発現が増加し，脊髄スライスからのATP放出も増加していることを見出しました。さらに，脊髄後角ニューロン特異的にVNUTを欠損させることで，ATP放出の増加が消失し，神経障害性疼痛も抑制されることを発見しました。一方で，アストロサイトやミクログリア選択的にVNUTを欠損させてもそのような抑制がみられませんでした。したがって，神経障害性疼痛に直結するATPの放出源は脊髄後角ニューロンであり，それがミクログリアのP2X4受容体をはじめとするATP受容体を活性化する可能性が示唆されました。この研究成果によって，私たちが2003年に神経障害性疼痛に対するP2X4受容体の重要性をNature誌に報告して以来，10年以上も謎であった細胞外ATPの放出源が明らかになりました。

マウス脊髄後角実質内への新しい微量注入法を開発

脊髄後角実質内へ薬物やウイルスなどを微量注入する場合，これまでは椎弓を切除（Laminectomy）する必要がありました。しかし，椎弓切除術は脊髄組織に大きなダメージを起こすため，それに伴う炎症反応が実験結果に悪影響を及ぼすことが懸念されていました。今回，私たちはマウスの椎弓間に骨で覆われていない部分を見つけ，それを利用することで椎弓切除することなく脊髄後角実質内へ物質を微量注入することに成功しました。この方法は，ウイルスによる脊髄後角の細胞種特異的な遺伝子制御を可能にし，オプトジェネティックスやDREADD，細胞ラベリングなど非常に幅広い実験系に応用することができます。

アトピー性皮膚炎に伴う慢性的な痒み　～新しい原因細胞を特定～

慢性的な痒みはアトピー性皮膚炎や接触性皮膚炎など炎症性の皮膚疾患における代表的な症状です。これまで，痒みは弱い痛みと位置づけられ基礎的な研究が非常に遅れていましたが，最近，痒みに特異的な物質および神経伝達経路の存在が明らかになり，その仕組みが徐々に明らかになってきました。しかし，慢性的な痒みの発症維持メカニズムはまだ分かっていません。私たちは，アトピー性皮膚炎と接触性皮膚炎モデルマウスを用いて，慢性的な引掻き行動により炎症を起こした皮膚に対応する脊髄後角でグリア細胞の一種であるアストロサイトが長期にわたり活性化されていること，さらに，アストロサイトで転写因子STAT3を抑制することによりこの活性化および慢性的な痒みが抑制されることを発見しました。さらに，アストロサイトのSTAT3に依存して発現上昇するLCN2が，脊髄後角における痒み誘発物質ガストリン放出ペプチド（GRP）の作用を増強することにより慢性的な痒みに関与することも突き止めました。今回の研究成果は，アトピー性皮膚炎など炎症性皮膚疾患における慢性的な痒みのメカニズムにおいて，これまで注目されてなかった中枢神経系のグリア細胞が重要な役割を担うことを世界で初めて明らかにしたもので，慢性的な痒みに対する新規の治療薬の開発への応用が期待されます。

神経障害性疼痛に重要なP2X4陽性ミクログリアを作り出す実行役

これまで私たちは，神経損傷後の脊髄で活性化し，P2X4受容体を高発現するミクログリアが神経障害性疼痛に重要であることを示してきました（Nature 2003; Nature 2005; PNAS 2009; EMBO J 2011; Cell Rep 2012）。しかし，神経損傷後にどのようなメカニズムでミクログリアでのみP2X4受容体が発現増加するのかは2003年から約10年間謎のままでした。この論文では，神経を損傷させたマウスの脊髄で転写因子のIRF5がミクログリア特異的に増えることを発見しました。この増加は，以前Cell Reports誌に報告したIRF8によって調節されていました。また，IRF5欠損マウスでは，神経損傷後の痛みが弱くなっていました。さらに，IRF5がP2X4受容体遺伝子のプロモーター領域に作用し，P2X4受容体を増やすように働いることを明らかにしました。したがって，IRF8からIRF5へ繋がる転写因子カスケードがP2X4受容体を高発現するミクログリアを作り上げるコアメカニズムであることを明らかにしました。

IRF8はミクログリアの活性化に重要な転写因子

脳や脊髄の免疫細胞と呼ばれるミクログリアが，神経損傷後の脊髄で過度に活性化した状態になり，神経障害性疼痛を引き起こしていることを明らかにしてきました（Nature 2003; Nature 2005; PNAS 2009; EMBO J 2011）。ミクログリアは，多くの分子が発現することで活動性を高めていきますが，そのたくさんの分子がどのように調節されているのか，その仕組みは不明でした。この論文では，神経を損傷させたマウスの脊髄で発現が増加する遺伝子をマイクロアレイで解析し，転写因子のIRF8を検出し，さらに脊髄におけるIRF8発現細胞がミクログリア特異的であることを発見しました（脳や脊髄におけるミクログリア特異的な転写因子としては世界初の例）。さらに，IRF8欠損マウスでは，ミクログリア活動を高める多くの分子の発現が軒並み減弱し，神経損傷後の痛みも緩和されていました。したがって，神経の損傷によってIRF8タンパク質が脊髄のミクログリアで増え，それが痛みを起こす分子を増加させ，神経障害性疼痛を引き起こすことを明らかにしました。

ミクログリアでのP2X4受容体発現増加に関与する損傷神経由来因子CCL21

神経損傷後に脊髄後角のミクログリアでP2X4受容体が発現増加するメカニズムとして，損傷神経由来因子の関与が想定されていました。今回の研究では，その因子としてケモカインのCCL21を特定しました。CCL21は，損傷した一次求心性神経で発現が誘導され，軸索輸送を介して脊髄後角へ運ばれ，ミクログリアに作用し，P2X4受容体の発現を増加させます。

JAK-STAT3経路はアストロサイトの活性化と神経障害性疼痛の維持に関与

神経障害性疼痛モデルの脊髄後角で早期に活性化するミクログリアは近年数多く研究されていますが，中枢神経系で数的に最も多いアストロサイトについてはほとんど研究がなされていませんでした。本研究では，末梢神経を損傷した神経障害性疼痛モデルの脊髄後角でミクログリアより遅くアストロサイトが活性化すること，その活性化に転写因子のSTAT3が関与すること，そしてSTAT3で活性化したアストロサイトは神経障害性疼痛の維持に重要であることを明らかにしました。この研究から神経障害性疼痛の維持メカニズムの一端が明らかになりました。

IFN-γ受容体シグナリングがミクログリアの活性化と神経障害性疼痛に関与

私たちはこれまで，神経損傷後に脊髄後角のミクログリアが活性化し，神経障害性疼痛の発症に極めて重要な役割を果たしていることを明らかにしてきました。しかし，そのミクログリアの活性化メカニズムは不明でした。脊髄後角のミクログリアは神経損傷後比較的早く活性化するため，活性化シグナルを受取るミクログリアの受容体は損傷前の正常時からすでに発現しているだろうと考え，様々な検索を経て，インターフェロン-γ（IFN-γ）受容体を特定しました。同受容体の発現は，中枢神経系ではミクログリア選択的であり，正常ラットへのIFN-γ髄腔内投与によりミクログリアが活性化し，アロディニアも発症しました。さらに，IFN-γ受容体欠損マウスでは神経損傷後のミクログリアの活性化とアロディニアが共に抑制されました。そのメカニズムとして，SrcチロシンキナーゼLYNが関与することも明らかにしました。IFN-γの産生細胞は未特定で今後の課題ではありますが，今回の研究成果により，神経障害疼痛に重要なミクログリアの活性化メカニズムの一端が明らかになりました。

ミクログリアからの脳由来神経栄養因子は脊髄後角ニューロンの機能異常を引き起こす

2003年にミクログリアのP2X4受容体の活性化が神経障害性疼痛に大切であることをNature誌に報告した。しかし，痛覚そのものは神経を伝わり脳まで到達するので，ミクログリアは何らかの形で神経活動を変化させるのであろうと考えられていました。今回の研究ではそのメカニズムを解明しました。脊髄後角のミクログリアはP2X4受容体の刺激で脳由来神経栄養因子BDNFという物質を細胞外に放出し，それが神経のTrkBに作用してイオントランスポーターKCC2の発現を減らし，細胞内の塩素イオン濃度を高め，通常，神経を抑制する物質GABAの作用を逆の興奮性へと逆転してしまうことを明らかにしました。

A big problem from molecules in "small" glia

2003年にNature誌に報告したP2X4受容体とミクログリアの重要な役割を中心に，これまで世界で報告されてきた神経障害性疼痛とミクログリアに関する成果をまとめて，脊髄後角における新しいメカニズムの仮説と，創薬を含めた将来展望などを論じています。

神経損傷後に脊髄ミクログリアで発現増加するP2X4受容体が神経障害性疼痛に重要

神経の損傷や圧迫，機能不全により発症する神経障害性疼痛は，触刺激で痛みを誘発する異痛症（アロディニア）を主な症状とし，非ステロイド性抗炎症薬やモルヒネなど既存の鎮痛薬にも抵抗性を示す難治性の慢性疼痛です。しかし，その発症メカニズムはまったく分かっていませんでした。

この研究では，神経障害性疼痛モデル動物の行動薬理学的解析から，脊髄のATP受容体（細胞外ATPなどのヌクレオチドで活性化する細胞膜受容体）を遮断する薬物で，アロディニアが著明に抑制されることを発見しました。その薬物の特性を調べた結果，１０種類以上あるATP受容体の中でP2X4受容体が関与することが判明しました。脊髄でのP2X4受容体の発現レベルは，正常状態では低いですが，モデル動物では顕著に増えていました。非常に興味深い点は，その発現増加が，これまで役割が全く不明であったミクログリアというグリア細胞のみで起こっていたことです。また，P2X4受容体を減らした動物では，アロディニアが抑制されることも分かりました。 この成果より，P2X4受容体とミクログリアが神経障害性疼痛に必須であることを世界で初めて明らかにしたことで，これまでの神経中心の疼痛メカニズムおよび治療薬開発コンセプトを一新するブレイクスルーとなりました。

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